一、實驗目的
熟練掌握Hungate厭氧操作技能，了解和掌握厭氧微生物的培養(yǎng)基配制，并進行分離純化。 二、實驗用具
裝有分壓表的氮氣鋼瓶，氫氣鋼瓶，調壓變壓器，銅柱和銅柱固定架，高壓滅菌鍋，厭氧管（15ml）,厭氧瓶(50ml)，異丁烯橡膠塞、電爐、圓底燒瓶（500ml、1000ml）、各種規(guī)格的定量注射器（1ml、2ml，5ml），18#針頭，酒精燈，酒精棉等。
三、實驗操作
(一)、高純無氧N2的制備
1、 接通電源：把輸出電壓緩緩從0伏分級升到50～90伏之間（調電壓的過程持續(xù)大約2-3s就可以了）。大約20
分鐘后，銅柱溫度能達到350℃左右（輸出電壓禁止長時間超過90V以上，否則會導致銅玻璃柱變形直**破裂，甚**發(fā)生安全事故）。
2、 待銅柱溫度升**350℃左右時，加熱套觸摸起來比較燙，開啟氫氣鋼瓶并形成氣流，使銅柱內的銅絲還原（反應
速率很快，幾秒鐘見效，還原與否可以從銅絲顏色的變化看到，同時柱內會產生水蒸氣，氧化銅與氫氣反應所致；通氫氣的時候**好打開窗戶，一定熄滅操作臺邊上所有明火，包括酒精燈和電爐）。
3、 待銅絲被氫氣還原呈現純紫銅錚亮色，同時把里面的水蒸氣也排出完全后，關閉氫氣鋼瓶，壓力表指針降為零；
打開氮氣鋼瓶，氣流大小以把針頭對準操作者手背5cm距離明顯感覺到氣流為宜，并隨時注意氣流是否足夠。 4、 使用完畢后，先關緊氮氣鋼瓶，使壓力表的指示針回**零位，接著關閉電源，使調壓變壓器調節(jié)指示回**0伏
處。
(二)、無氧無菌水的配制
1. 將500ml一定濃度的NaCl水溶液（防止稀釋時細胞漲破）沿玻璃棒倒入固定在鐵架臺上的1000ml圓底燒瓶
中（選擇合適的圓底燒瓶，水不可太滿，否則水沸騰時容易濺出），**好放入幾個防爆玻璃珠。向500ml水中加入終濃度為0.001‰的刃天青（resazurin），即加入0.5ml 的1‰刃天青母液（W/V），并加入0.25g半胱氨酸（L-Cysteine）(終濃度0.5‰)。在燒瓶外壁溶液水平面處劃一刻度后，加入適量水（因為蒸發(fā)會損失部分水分）。煮沸5-10min（視所加水總量而定），刃天青會根據水中含氧量的下降經歷紫色-紅色-無色的顏色變化，當溶液變?yōu)闊o色后，再煮沸5min，然后通高純氮氣1-2min（趕走空氣）。
2. 分裝的過程可以不用繼續(xù)加熱，用10ml的定量注射針筒抽進氮氣流，再打出（三次以上）洗氣，然后抽取
9ml無氧水注入已換氣的15ml厭氧管中（抽取注射過程中應迅速利落，與空氣接觸時間應縮****短）；注入厭氧管后，需要等待通氣5s-10s，以置換瓶中空氣，在抽出氮氣流針頭的同時塞緊異丁烯橡膠塞（操作要*：抽出針頭時要注意，橡膠塞應該先半扣到瓶口，然后用右手食指撳住，左手捏住通氣針頭慢慢抽出針頭，橡膠塞可能會外翻導致漏氣等，此時將針頭往瓶內伸，使塞子恢復原樣，有時需要反復多次，視塞子大小而定，**后拔出針頭，拔出同時立即將塞子塞進管口），**后旋緊蓋子。 3. 121℃高壓蒸汽滅菌20min。
（三）、專性厭氧菌液體培養(yǎng)基配制（以制備1000ml為例）
1、 按照配方配制培養(yǎng)基，定容后，加入1ml的1‰刃天青母液（W/V）(終濃度0.001‰)，0.4g的半胱氨酸（L-Cysteine）
(終濃度0.4‰)，用NaOH或KOH調節(jié)pH值（resazurin和半胱氨酸對培養(yǎng)基的pH有影響，應加入后再測pH）。2、 制備高純氮氣，操作過程同（一）；將厭氧管固定到鐵架臺的夾子上并通氮氣，在培養(yǎng)基中加入5% Na2S•9H2O
溶液，使其終濃度為0.5‰，用槍吸取適量培養(yǎng)基注入到厭氧管（或厭氧瓶中），通氣10-20S，塞上橡膠塞，旋緊蓋子。
3、 厭氧試管用牛皮筋扎成7支或者10支一捆即可滅菌，121℃濕熱滅菌20min。 （四）厭氧菌固體培養(yǎng)基配制 1、 同（三）1。
2、 取上述培養(yǎng)基注入母液圓底燒瓶中（可以預先在圓底燒瓶外壁用記號筆劃上體積刻度），再
加瓊脂粉和適量蒸餾水以彌補在煮沸過程中蒸發(fā)的損失量。然后煮沸15-20mins，驅除培養(yǎng)基中的溶解氧。(應特別注意：融化的固體培養(yǎng)基在沸騰時容易從燒瓶瓶口溢出引起電爐短路，從而將電爐燒壞)，在接近沸騰時要把電爐移開。
3、 煮沸10分鐘后，開始通高純氮氣；將厭氧管固定到鐵架臺的夾子上并通氮氣，加入5% Na2S•9H2O溶液，使其
終濃度為0.5‰。然后用10ml的定量注射針筒取5ml培養(yǎng)基注入15ml已換氣的厭氧試管中。（注意：因為是固
體培養(yǎng)基，注射器活塞處容易被瓊脂粘住，使得封閉性較高，相對來說不易變紅，但是也會有少許顏色，不用擔
心，同樣加入少量硫化鈉到管子或者瓶子內即可）。
4、 滅菌后的培養(yǎng)基取出來，就進行滾管操作。使滅完菌還未冷卻的固體培養(yǎng)基在桌面勻速滾動，
培養(yǎng)基會均勻固定在厭氧管壁上；也可以做成斜面狀，但是如果是分菌的話應該是滾管更加好點，因為接觸面積大。**后，管底會留有稍許的冷凝水。
5、 注：如果是制備少量固體培養(yǎng)基，也可先在厭氧管中加入終濃度為2%的瓊脂后按液體培養(yǎng)#p#分頁標題#e#
基的配制方法配制。滅好菌后，把瓊脂搖勻后滾管或擺斜面。
（五）厭氧菌分離純化
1、富集培養(yǎng)：用滅菌小鐵鍬鏟取0.5g-2.5g樣品**裝有20-25ml培養(yǎng)基的厭氧瓶內，充N2 ，塞緊塞子，然后振蕩均勻，
一定溫度下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)幾天后進行稀釋涂布，方法在“直接涂布法”中有詳細介紹。 2、直接涂布法：
1）樣品梯度稀釋：取含9ml無氧無菌水的厭氧試管若干支，用無菌1ml定量注射器以10倍稀釋法稀釋污泥菌懸液**
合適濃度（稀釋度視樣品生長情況而定, 要注意用1ml注射器與18#針頭結合時，1ml注射器的量程已經不準確，經過移液槍的確定，0.7ml刻度處即相當于1ml）。由于沒有經過富集所以樣品中含有的菌量較少，直接涂布法中菌懸液的稀釋度做到10-2就可以了；而富集后的菌液為得到單菌落，稀釋度一般要做到10-6。
2）涂布：用無菌1ml定量注射器取相應稀釋度的污泥菌懸液0.2ml于含4.5ml的固體培養(yǎng)基的厭氧試管中，立即滾管。
滾管的要*是：注射器從梯度稀釋液轉移到滾管之內后，塞緊塞子，將稀釋液均勻涂滾于厭氧管壁內，然后再取出塞子，通無氧高氮氣體，用無菌注射器與無菌針頭將多余的液體（包括了原來的冷凝水與稀釋液）吸出來，可防止過多的水滯留導致滾管模糊、菌落不清。
3）培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度以及培養(yǎng)時間看菌的生長來定，有些只要兩三天，長的需要十來天，這些可以查其他科技工作者
所做的相關屬菌株的條件來設定，一般如果條件合適，3天左右會有菌落長出。 （六）厭氧菌菌落的觀察和純化
1、觀察 4d培養(yǎng)后，觀察厭氧試管內壁上出現菌落；
2、純化 多次涂布滾管，挑單菌落純化，若在低稀釋度下形成了單克隆菌落，那么可以認為其已經比較純，也可以做
鑒定工作，比如簡單染色觀察菌落形態(tài)是否一致等。建議：
1. 將刃天青配成母液，母液濃度為1‰（W/V），4℃冰箱放置。
2、專性厭氧菌生長于很低的氧化還原電勢下，其呼吸鏈末端電子受體為無機氧化物和有機氧化物的生物氧化，這是一類在無氧或低氧條件下進行的產能效率較低的呼吸形式。
3、刃天青的指示：刃天青在氧化態(tài)時呈紫絳色，在完全還原時為無色，它**步不可逆地還原為Resorufin, 呈現桃紅色，然后再可逆性地還原為無色的二氫Resorufin。如果制備的培養(yǎng)基呈現桃紅色，表明培養(yǎng)基已經被氧化，氧還電位已升高。其還原指示電位為-42mv。
