一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容
目的：學(xué)習(xí)培養(yǎng)厭氧微生物的方法，了解厭氧微生物生長的特性。 內(nèi)容：1、深層穿刺法，厭氧培養(yǎng)丙酮丁醇梭菌。
2、真空干燥器厭氧培養(yǎng)丙酮丁醇梭菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌。 3、針筒厭氧法培養(yǎng)丙酮丁醇梭菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌。 4、厭氧罐培養(yǎng)法示范。
5、厭氧袋法培養(yǎng)丙酮丁醇梭菌。 二、實(shí)驗(yàn)材料和用具
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)。 RCM培養(yǎng)基（即強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基）、TYA培養(yǎng)基、玉米醪培養(yǎng)基、中性紅培養(yǎng)基、明膠麥芽汁培養(yǎng)基。CaCO3，焦性沒食子酸(即鄰苯三酚)、Na2CO3，10%NaOH溶液，0.5%美藍(lán)水溶液，6%葡萄糖水溶液，鈀粒(A型)，NaBH4，KBH4，NaHCO3，檸檬酸。
帶塞或塑料帽玻璃管(直徑18~20mm，長180~200mm)，1mL血漿瓶，250mL血漿瓶，2OmL和50mL針簡，250mL三角瓶，試管，厭氧罐，厭氧袋(不透氣的無毒復(fù)合透明薄膜塑料袋，14cm×32cm)，培養(yǎng)皿，真空泵，帶活塞干燥器，氮?dú)怃撈俊?三、操作步驟
(一)真空干燥器厭氧培養(yǎng)法
此法不適用于培養(yǎng)需要CO2的微生物。該法是在干燥器內(nèi)使焦性沒食子酸與氫氧化鈉溶液發(fā)生反應(yīng)而吸氧，形成無氧的小環(huán)境而使厭氧菌生長。
1．培養(yǎng)基準(zhǔn)備與接種 將3支裝有玉米醪培養(yǎng)基或RCM培養(yǎng)基的大試管放在水浴中煮沸l(wèi)0min，以趕出其中溶解的氧氣，迅速冷卻后(切勿搖動(dòng))將其中2支試管分別接種丙酮丁醇梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌。 2．干燥器準(zhǔn)備與抽氣 在帶活塞的干燥器內(nèi)底部，預(yù)先放入焦性沒食子酸粉末20g和斜放盛有200mL10% NaOH溶液的燒杯。將接種有厭氧菌的培養(yǎng)管放入干燥器內(nèi)。在干燥器口上涂抹凡士林，密封后接通真空泵，抽氣3~5min，關(guān)閉活塞。輕輕搖動(dòng)干燥器，促使燒杯中的NaOH溶液倒入焦性沒食子酸中，兩種物質(zhì)混合發(fā)生吸氧反應(yīng)，使干燥器中形成無氧小環(huán)境(圖18-lA) 3．觀察結(jié)果 將干燥器置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)約7d，取出培養(yǎng)管，分別制片觀察菌體特征。 (二)深層穿刺厭氧培養(yǎng)法
此法操作簡單，適用于一般厭氧微生物的活化和分離培養(yǎng)，但不能用于擴(kuò)大培養(yǎng)。
1．接種培養(yǎng) 將玻璃管一頭塞上橡膠塞，裝入培養(yǎng)基(RCM或TYA培養(yǎng)基)的高度為管長的2/3，套上塑料帽或橡皮塞，滅菌并凝固后，將丙酮丁醇梭菌用接種針穿刺接種(圖18—lB)，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)6～7d。
2．觀察結(jié)果 觀察菌落形態(tài)特征并制片于顯微鏡下觀察菌體的細(xì)胞形態(tài)，并記錄結(jié)果。 (三)針筒厭氧培養(yǎng)法
此法適于活化厭氧菌和小體積的擴(kuò)大培養(yǎng)。 1．培養(yǎng)基準(zhǔn)備 將滅菌的裝有RCM或TYA培養(yǎng)基的血漿瓶放在沸水浴中加熱10min，在瓶口膠塞上插上2枚醫(yī)用針頭排氣，以趕出殘留在培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣。隨后將血漿瓶從沸水浴中取出，再用氮?dú)怃撈恐械母呒兊獨(dú)?99.99%)通過膠塞上的一枚針頭引人血漿瓶中，使血漿瓶內(nèi)充滿氮?dú)?，瓶?nèi)培養(yǎng)基在冷卻過程中保持無氧狀態(tài)。 2．針筒裝灌培養(yǎng)基 將滅菌的針筒接上針頭經(jīng)膠塞刺人血漿瓶中，先利用瓶內(nèi)氮?dú)獾膲毫⑨樛驳耐茥U慢慢推開，待吸入一定體積的氮?dú)夂笕∠箩樛玻疟M針筒內(nèi)的氣體。按此重復(fù)操作3次，以排盡針筒內(nèi)的殘留空氣而維持無氧狀態(tài)。使血漿瓶口朝下傾斜，利用瓶內(nèi)壓力將培養(yǎng)液緩慢注入針筒內(nèi)，然后取下針筒，用經(jīng)滅菌的帶孔橡皮塞迅速把針筒頭部塞住(圖18-2)。
3．接種培養(yǎng)采用無菌操作以菌種液針筒將菌穿刺接入培養(yǎng)液針筒中(圖18-3)，置37℃恒溫培養(yǎng)，用于菌種活化可培養(yǎng)16~18h，用于測定菌體生長可培養(yǎng)6~7d。 4．觀察結(jié)果取菌制片觀察。 (四)厭氧罐培養(yǎng)法
此法利用透明的聚碳酸酯硬質(zhì)塑料制成的一種小型罐狀密封容器，采用抽氣換氣法充入氫氣，利用鈀作催化劑與罐內(nèi)氧氣發(fā)生作用達(dá)到除氧的目的，同時(shí)充入10%(V/V)的CO2以促進(jìn)某些革蘭氏陰性厭氧菌的生長(圖18-4)。 其實(shí)驗(yàn)操作過程如下： 1．制備厭氧度指示劑 取3mL0.5%美藍(lán)水溶液用蒸餾水稀釋**100mL；6mL0.1mol/LNaOH溶液用蒸餾水稀釋**l00mL；6g葡萄糖加蒸餾水**l00mL。將上述3種溶液等體積混合，并用針筒注入安瓿管內(nèi)lmL，沸水浴加熱**無色，立即封口即成。取一根直徑1cm、長8cm的無毒透明塑料軟管，將裝有美藍(lán)指示劑的安瓿管置于軟管中，制成美藍(lán)厭氧度指示管。 2．培養(yǎng)基準(zhǔn)備與接種 將制成無菌無氧的RCM或TYA培養(yǎng)基平板，在無菌操作下迅速劃線接種丙酮丁醇梭菌或產(chǎn)氣莢膜梭菌，并立即將平皿倒置放入已準(zhǔn)備好的厭氧罐中，同時(shí)放入一支美藍(lán)厭氧指示劑管。隨后及時(shí)旋緊罐蓋，達(dá)到完全密封。
3．抽氣換氣 將真空泵接通厭氧罐抽氣接口(圖18-4)，抽真空**表指針0.09~0.093MPa(680~700mmHg柱)時(shí)，關(guān)閉抽氣口活塞，用止血鉗夾住抽氣橡皮管。打開氮?dú)怃撈繗忾y向厭氧罐內(nèi)充入氮?dú)猓?dāng)真空表指針返回到零位終止充氮。再接上述步驟抽氣和充入氮?dú)?，如此重?fù)2~3次，使罐中氧的含量達(dá)**低度。**后充入的氮?dú)馐拐婵毡碇羔樳_(dá)0.02MPa(l60mmHg)時(shí)停止充氮?dú)?。再開啟CO2鋼瓶閥門，向罐內(nèi)充入CO2直**真空表指針達(dá)到0.011MPa(80mmHg)時(shí)停止。為除盡罐內(nèi)殘留的氧，以氫氣袋(用醫(yī)用“氧氣袋”灌滿氫氣)氣管連接向厭氧罐內(nèi)充入氫氣直**真空表指針回到零位為止。充氣完畢，封閉厭氧罐。 #p#分頁標(biāo)題#e#
4．恒溫培養(yǎng) 將厭氧罐置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)6~7d，注意罐中厭氧指示劑的顏色變化。 5．觀察結(jié)果和鏡檢 從罐內(nèi)取出平皿，觀察菌落特征。并挑取菌落作涂片，用結(jié)晶紫染液染色，鏡檢，比較不同菌的菌體細(xì)胞形態(tài)特征，并作記錄。 (五)厭氧袋培養(yǎng)法
厭氧袋除氧是利用氫硼化鈉與水反應(yīng)產(chǎn)生氫，在催化劑鈀的作用下，氫與袋中氧結(jié)合生成水達(dá)到除氧目的，除氧效果可從袋中厭氧度指示劑觀察。同時(shí)，利用檸檬酸與碳酸氫鈉的作用產(chǎn)生CO2，以有利于需要CO2的厭氧菌的生長。 其反應(yīng)過程為：
1．厭氧袋 選用無毒復(fù)合透明薄膜塑料，采用塑膜封口機(jī)或電熱法燙制成20×40cm塑料袋。
2．產(chǎn)氣管 取一根無毒塑料軟管(直徑2.0cm，長20cm)，管壁制成小孔，一端封實(shí)。天平稱取0.4g NaBH4和0.4g NaHCO3，用擦鏡紙包成小包，塞入軟管底部，其上基入3層擦鏡紙，將裝有5%檸檬酸溶液3mL的安瓿管塞入塑料管中，管口塞上有缺口的泡沫塑料小塞，即制成產(chǎn)氣管。
3．厭氧度指示管 取一根無毒透明塑料軟管(直徑2cm，長10cm)。量取0.5%美藍(lán)水溶液3mL，用蒸餾水稀釋**100mL；取0.lmol/LNaOH溶液6mL，用蒸餾水稀釋**100mL；稱取6g葡萄糖加蒸餾水稀釋成100mL。將上述3種溶液等量混合后取2mL裝入安瓿管，經(jīng)沸水浴加熱**無色后立即封口，即為厭氧度指示管。
4．催化劑和吸濕劑 催化劑鈀粒(A型)10~20粒加熱活化，隨后裝入帶孔的小塑料硬管內(nèi)，制成鈀粒催化管。取變色硅膠少許，用濾紙包好塞入帶孔塑料管內(nèi)，為吸濕劑管。
5．培養(yǎng)基準(zhǔn)備和接種 將滅菌的中性紅培養(yǎng)基和CaCO3明膠培養(yǎng)基分別在沸水浴中煮沸10min，以趕出其中溶解的氧，冷卻**50C左右倒平板，冷凝后接種丙酮丁醇梭菌。隨后立即將平皿放入?yún)捬醮?，每袋可倒置平?個(gè)平皿。
6．封袋除氧和培養(yǎng) 將產(chǎn)氣管、厭氧度指示管、鈀粒催化劑管和吸濕劑管分別放入袋中平皿兩邊，盡量趕出袋中空氣，用寬透明膠帶將袋口封住，用一根lcm寬、與袋口寬等長的有機(jī)玻璃條或小木條將袋口卷折2~3層，用夾子夾緊，嚴(yán)防漏氣(圖18-5)。使袋口傾斜向上，隨后隔袋折斷產(chǎn)氣管中的安瓿管頸，使試劑反應(yīng)產(chǎn)生H2和CO2，H2在鈀粒催化下與袋內(nèi)O2化合生成水。經(jīng)5~l0min左右，鈀粒催化管處升溫發(fā)熱，生成少量水蒸汽。在折斷產(chǎn)氣管半小時(shí)后，隔袋折斷厭氧度指示管中的安瓶管頸，觀察指示劑不變藍(lán)，表明袋內(nèi)己形成厭氧環(huán)境。此時(shí)將厭氧袋轉(zhuǎn)入37℃恒溫箱中培養(yǎng)6~7d。 7．觀察結(jié)果和鏡檢 從袋中取出平皿觀察菌落特征。丙酮丁醇梭菌在中性紅平板上顯示黃色菌落，挑取典型單菌落涂片染色后進(jìn)行鏡檢，觀察菌體細(xì)胞形態(tài)特征，并作記錄。 四、注意事項(xiàng)
1．培養(yǎng)需要CO2的厭氧菌時(shí)，須在厭氧小環(huán)境中供應(yīng)CO2。
2．氫氣是危險(xiǎn)易爆氣體，使用氫氣鋼瓶充氫時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行，切勿大意，嚴(yán)防事故。
3．選用干燥器、針筒、厭氧罐或厭氧袋時(shí)，應(yīng)事先仔細(xì)檢查其密封性能，以防漏氣。
4．已制備滅菌的培養(yǎng)基在接種前應(yīng)在沸水浴中煮沸10min，以消除溶解在培養(yǎng)基中的氧氣。 5．針筒培養(yǎng)液刃天青指示劑出現(xiàn)紅色，表明有殘留氧氣。厭氧袋和厭氧罐中美藍(lán)厭氣度指示劑變成藍(lán)色，表明除氧不夠。
6．產(chǎn)氣莢膜梭菌為條件致病菌，防止進(jìn)入口中和沾上傷口。 五、演示
1．顯示深層穿刺厭氧培養(yǎng)的厭氧菌菌落特征及生長情況。
2．選用真空干燥器、針筒、厭氧罐或厭氧袋厭氧培養(yǎng)法，演示該方法的操作過程，特別是厭氧罐的抽氣換氣和厭氧袋的封袋除氧操作過程。 六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告
1．實(shí)驗(yàn)中選用厭氧培養(yǎng)法的培養(yǎng)結(jié)果：
2．試比較以上厭氧培養(yǎng)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并分析其成功的關(guān)鍵。 七、問題和思考
1．請?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)試驗(yàn)方案，如何從土壤中分離、純化和培養(yǎng)出厭氧菌。 2．試舉例說明研究厭氧菌的實(shí)際意義。
